一、引言

　　納米技術(shù)(nanometer technology)主要是針對尺度為1nm~100nm之間的分子世界的一門技術(shù)。該尺寸處在原子、分子為代表的微觀世界和宏觀物體交界的過渡區(qū)域，基于此尺寸的系統(tǒng)既非典型的微觀系統(tǒng)亦非典型的宏觀系統(tǒng)，因此有著獨特的化學性質(zhì)和物理性質(zhì)，如表面效應(yīng)、微尺寸效應(yīng)、量子效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等。

　　納米技術(shù)引入生物傳感器領(lǐng)域后，提高了生物傳感器的檢測性能，并促發(fā)了新型的生物傳感器。因為具有了亞微米的尺寸、換能器、探針或者納米微系統(tǒng)，生物傳感器的化學和物理性質(zhì)和其對生物分子或者細胞的檢測靈敏度大幅提高，檢測的反應(yīng)時間也得以縮短，并且可以實現(xiàn)高通量的實時檢測分析。本文就納米技術(shù)在生物傳感器中的應(yīng)用作一介紹，包括多種納米結(jié)構(gòu)的性能和制作。

　　二、納米結(jié)構(gòu)

　　納米結(jié)構(gòu)在生物傳感器中應(yīng)用非常廣泛，納米結(jié)構(gòu)可以是管道、纖維、顆粒、光纖以及薄膜和多孔體等。下面就不同納米結(jié)構(gòu)在生物傳感器中應(yīng)用分別進行介紹。

　　1、納米顆粒在生物傳感器中的應(yīng)用

　　關(guān)于納米顆粒的研究很多，例如將功能性納米顆粒(如電子性質(zhì)的、光學性質(zhì)的和磁性的)固定在生物大分子(如多肽、蛋白、核酸)上，可制成用于生物信號檢測、信號轉(zhuǎn)換和放大的傳感器，其可分為聲波、光學、磁性和電化學等種類。

　�。�1）聲波生物傳感器

　　聲波生物傳感器是檢測待檢測物質(zhì)引起聲波頻率改變的傳感器。其中，被研究最多的是石英晶體微天平(quartz crystal microbalance, QCM)生物傳感器。其壓電晶體常用AT方式(AT切割指切割面與石英晶體主光軸成25.15°，此刻，在室溫下晶體共振溫度系數(shù)接近于零)，在晶體的兩面則采用離子束沉積等方法形成兩個平行金屬 (Au，Ag，Pt，Ni，Pd等)膜電極。膜電極的表面固定識別分子，識別分子因其有特異性而結(jié)合待檢測分子，引起電極表面的質(zhì)量變化，從而改變石英晶體的振蕩頻率。如果在待檢測分子上修飾納米顆粒，會顯著提高待檢測分子的質(zhì)量，則檢測信號也隨之增強。Ward[1]等人用納米膠顆粒標記抗體，通過抗體－抗原免疫方法將其結(jié)合到石英晶體表面，由于修飾膠體顆粒(溶膠顆粒的直徑在5~100nm)提高了標記分子的質(zhì)量，根據(jù)Sauerbrey方程，石英晶體的振蕩頻率也相應(yīng)得以提高，因而檢測信號被放大，檢測靈敏度提高，檢測下限也降低了。

　�。�2）光學生物傳感器

　　納米金屬顆粒可以用于光共振檢測，Bauer[2]等人通過抗原－抗體或蛋白－受體結(jié)合等方法在導電材料表面固定納米金屬顆粒團，由于納米顆粒反射偶極子的相互作用，引起反射光的共振增強，通過檢測共振信號即可探知待檢測物質(zhì)。納米顆粒也可以用來定位腫瘤，熒光素標記的識別因子與腫瘤受體結(jié)合，然后在體外用儀器顯示出腫瘤的大小和位置。

　　納米金屬顆粒還可以作為一種通用的熒光湮滅基團。Maxwell[3]等人在寡核甘酸探針分子的兩端分別標記納米金顆粒和熒光激發(fā)基團，探針由于堿基互補形成“發(fā)卡”結(jié)構(gòu)，熒光激發(fā)基團和納米金顆粒靠近，引起激發(fā)熒光湮滅；而當探針與特異性靶DNA結(jié)合后，其構(gòu)象發(fā)生變化，納米金顆粒和熒光激發(fā)基團分離，從而激發(fā)出熒光。該原理可用于核酸的實時熒光檢測，以及單堿基突變多態(tài)性檢測等。

　　（3）磁性生物傳感器

　　磁性納米顆粒在生物檢測和藥物分析上有著重要的應(yīng)用價值。通過磁性材料標記生物分子，結(jié)合分子識別技術(shù)，可以實現(xiàn)樣品的混合、分離、檢測等復雜操作。Šafařík和Šafaříková[4]Richardson等人通過磁免疫分析技術(shù)，用磁力計數(shù)器檢測磁性標記分子。另外，用納米磁性顆粒標記識別因子，與腫瘤表面的靶標識別器結(jié)合后，可在體外測定磁性顆粒在體內(nèi)的分布和位置，從而給腫瘤定位。等人用磁性材料標記分子，在磁場梯度下實現(xiàn)樣品的分離和檢測。

　　Chemla[6]等人利用順磁性的納米顆粒和基于高溫瞬態(tài)直流超導量子界面裝置(superconducting quantum interference device，SQUID)的顯微鏡，提出了一種新穎的生物樣品的快速檢測技術(shù)。首先，把固定抗體的磁性顆粒懸浮在溶液中，然后在瞬時磁場脈沖下，磁化納米顆粒產(chǎn)生，當磁場消失時，顆粒趨向自由分布，因為沒有結(jié)合抗體的顆粒呈布朗運動，所以沒有檢測信號；而結(jié)合靶分子的納米顆粒按照Neel松弛方式運動，產(chǎn)生一個緩慢衰減的磁信號，通過SQUID采集的信號即可分析出待檢測物質(zhì)。該技術(shù)無需分離未結(jié)合待檢測分子的納米顆粒，可以直接檢測標記分子，縮短了檢測時間，提高了檢測效率。

　�。�4）電化學生物傳感器

　　膠體金是最常見的金屬納米顆粒，可以用于生物分子的標記，從而實現(xiàn)信號的檢測和放大；此外，它還可廣泛應(yīng)用于TEM、SEM表征和試紙條顯色等方面。許多文獻也報道了膠體金在各種生物傳感器中的信號放大作用。Gonzalez-Garcia[7]等人利用膠體金標記，結(jié)合電化學方法來研究生物素—親和素之間的作用。通過把生物素化的白蛋白修飾在電極表面，然后與10nm直徑膠體金標記的親和素反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)由膠體金引起的電流響應(yīng)和親和素濃度線性相關(guān)(2.5×10-9mol/L ~2.5×10–5mol/L)。

　　納米粒子具有極佳的比表面積，可用于生物分子的固定，能增加固定的分子數(shù)量，從而實現(xiàn)信號的放大。Singh等人用sol-gel方法合成硅納米顆粒，其直徑為20nm或200nm。在納米顆粒表面固定乙酰膽堿脂酶，可用于制造有機磷農(nóng)藥生物傳感器，由于具有較高的比表面活性，結(jié)合離子敏場效應(yīng)管檢測，響應(yīng)迅速(<10s)，靈敏度高，對paraoxon殺蟲劑的檢測下限可達1×10-6mol/L。Cai[8]等人把膠體金納米顆粒固定在胱氨酸修飾的金電極表面，增加了ssDNA探針的固定效率，提高了檢測的靈敏度。

　　金屬納米顆粒作為催化劑的載體，可以大大提高催化劑的性能。酶－膠體金固定在電極表面，可用于H2O2、葡萄糖、黃嘌呤、次黃嘌呤等電化學檢測。Xu[9]等人在絲網(wǎng)印刷的碳電極表面用膠體金修飾，結(jié)合免疫結(jié)合山葵過氧化酶(HRP)制作H2O2生物傳感器，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HRP的電催化性能和電流響應(yīng)顯著改善，信號線性范圍有了很大的提高(0.8μM~1.0mM)，檢測下限也降低至0.4μM。

　　2、納米導線

　　采用攙硼硅(silicon nanowires，SiNWs)制作而成的納米導線，可以提高生物傳感器的電化學檢測靈敏 度。Cui[10]等人用胺和羥基修飾SiNWs，制作成納米PH計。由于導線表面修飾基團在溶液中的質(zhì)子化和去質(zhì)子化，引起導線的電導率改變，而導線的電導率與溶液的PH值呈線性關(guān)系，因此可以探測環(huán)境中的PH測量。另外，Cui等人用生物素修飾的SiNWs可以檢測到pmol濃度的鏈霉素抗生物素蛋白。固定抗原的SiNWs還可用于抗體的可逆結(jié)合和實時定量檢測。研究表明，半導體的納米導線可以制作高靈敏度、無標記和實時檢測的生物傳感器及其陣列。

　　3、納米微管和多孔納米結(jié)構(gòu)

　　微管和多孔結(jié)構(gòu)可以保持生物分子的活性和提高分子的固定效率，而采用尺寸更小、比表面積更大的納米微結(jié)構(gòu)，可以進一步改善生物傳感器的性能。

　�。�1）納米微管

　　納米微管的研究報道很多，其中，以碳納米管的研究最熱。碳納米管有著優(yōu)異的表面化學性能和良好的電學性能，是制作生物傳感器的理想材料。無論是單層碳納米管(single-wall nanotubes，SWNT)還是多層碳納米管(multi-wall nanotubes，MWNT)在生物傳感器中都有應(yīng)用。與常規(guī)的固態(tài)碳傳感器相比，碳納米管制作的生物傳感器的靈敏度高、反應(yīng)速度快，檢測溫度范圍廣。據(jù)報道，Azamian等人[11]SWNT表面固定葡萄糖氧化酶，使酶的催化活性比普通碳電極固定的酶的催化活性提高1個數(shù)量級。K. Aihara[12]等人制作了微波碳納米管電磁共振生物傳感器，用于氣體和生物分子的靈敏檢測。他們將長3μm～10μm直徑1.4nm～25nm的SWNTs固定在微加工的電磁共振器的表面，在不同的有機氣體環(huán)境中，共振器表面吸收有機氣體引起共振頻率改變，例如，異丙醇(IPA)使傳感器的共振頻率遷移2MHz～3MHz；而當恢復原來氣體環(huán)境時，傳感器的共振頻率逐漸恢復。曾在
Miao[13]等人發(fā)現(xiàn)了一種聚吡咯(polypyrrole)納米微管。利用化學或電化學方法使吡咯單體在模板孔隙中生長，可得到與模板相應(yīng)結(jié)構(gòu)的納米管。這種微管具有統(tǒng)一直徑、上下連通、管壁多孔的特點。它具有較大的比表面積，能容納大量的酶分子，并減少反應(yīng)物和產(chǎn)物的擴散障礙，有效地提高酶電極的性能。

　�。�2）納米多孔硅

　　對單晶硅進行電化學腐蝕可以得到具有納米孔徑的多孔硅，這種材料在室溫下可發(fā)射可見光，具有高比表面積 (500m2/cm3)以及與現(xiàn)有硅加工技術(shù)相容等優(yōu)點。前一優(yōu)點增加了可固定敏感分子的數(shù)量，從而提高了靈敏度，后一優(yōu)點則便于各種形式的微加工和大規(guī)模生產(chǎn)。在多孔硅的表面固定寡核苷酸、生物素或者抗體等識別分子，通過檢測光干涉和折射率的變化，從而能構(gòu)建一種新型的免標記生物傳感器[14]cDNA的檢測，靈敏度可達194. 2fmol/L。。其可用于
 
　　4、光纖納米生物傳感器

　　與其它類型的生物傳感器相比，光纖納米生物傳感器非但體積微小、靈敏度高，而且不受電磁場干擾，不需要參比器件。它可以進入細胞內(nèi)部，對細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和細胞質(zhì)的變化進行在線體測量。

　　（1）光纖納米熒光生物傳感器

　　Kopelman[15-16]最早使用了熒光法的光纖納米傳感器，以檢測微環(huán)境中的PH值。其工作原理是在光纖頭部固定熒光劑，在熒光劑與質(zhì)子發(fā)生可逆反應(yīng)時，液體光學性質(zhì)發(fā)生變化，根據(jù)熒光強度的變化即可測定PH值。光纖處理的方法如下：用光纖拉制儀將光纖拉制成頭部直徑為100nm~1000nm的光纖探針，用真空蒸發(fā)器在光纖表面鍍上鋁，以防止光在傳輸過程中外泄，然后將暴露的光纖頭部硅烷化，表面修飾成含羥基或氨基的活性表面，固定識別待檢測分子的抗原或抗體，最后在光纖頭部結(jié)合上一種PH選擇性熒光染料聚合物。該納米傳感器響應(yīng)時間為250ms，可以檢測濃度為μM的離子。這些特性適宜于對單個細胞和亞細胞結(jié)構(gòu)的檢測，例如進行小鼠胚胎細胞液PH值的檢測。

　�。�2）光纖納米免疫生物傳感器

　　光纖納米免疫傳感器是將光學與光子學技術(shù)應(yīng)用于免疫法，利用抗原抗體能發(fā)生特異性結(jié)合的性質(zhì)，將感受到的抗原量或抗體量轉(zhuǎn)換成光學信號的一類傳感器，這類傳感器集傳統(tǒng)的免疫測試法與光學、生物傳感技術(shù)的優(yōu)點集一身，具有很高的特異性、敏感性和穩(wěn)定性。同時，光纖納米免疫傳感器只是在將敏感部件上使用了納米產(chǎn)品，因此既保留了原來的諸多優(yōu)點，又使之能適用于單個細胞的測量。Dinh[17-18]等人成功地研制出一種用于檢測BPT(Benzo pyrene tetrol，是一種與暴露于致癌物質(zhì)苯并[α]芘相關(guān)的DNA損傷的生物標志物)的光纖納米免疫傳感器。他們首先用光纖拉制儀制作直徑10nm~100nm的石英光纖，然后將光纖頭部硅烷化，并用BPT的抗體修飾光纖頭部，隨后將光纖全長(修飾的光纖頭部除外)鍍銀以防止光漏出，最后在單細胞操作的顯微操縱儀/顯微注射器上進行細胞穿刺及檢測實驗，用光電倍增管PMT記錄BPT與抗體結(jié)合后產(chǎn)生的熒光，通過測定熒光強度的變化檢測細胞內(nèi)BPT的含量。該傳感器的最低檢出限可以達到10 –21mol。

　　5、納米微加工

　　納米微加工技術(shù)融合了IC工藝和MEMS工藝，主要包括光刻、薄膜的生長/淀積、離子注入、腐蝕和鍵合等四個加工步驟。近年來，分子自組裝成為微細加工發(fā)展的新方向。
L. Malaquin[19]等人采用電子束光刻工藝制作納米電極。在光滑的硅襯底材料上，用電子束曝光、剝離(Lift-off)等工藝制作出金納米電極結(jié)構(gòu)，最小線寬可以達到20nm。該納米電極可用于直徑為100nm膠體金的電化學檢測。

　　IBM公司和瑞典Basel[20]大學的研究人員正在開發(fā)一種新型的納米微懸梁生物傳感器，利用DNA分子的雙螺旋機構(gòu)作為分子特異性識別能力的模型。器件的核心是硅懸梁天平陣列，長500μm，寬100μm，厚度為1μm。當生物分子結(jié)合時，懸梁臂開始彎曲，通過激光反射技術(shù)， 10nm~20nm的彎曲都能被檢測到。在懸梁天平陣列表面固定具有不同識別性的分子，構(gòu)成陣列式生物傳感器，可以同時檢測多項指標。

　　美國Naval[21]研究實驗室進一步改進了懸臂梁生物傳感器，提出了磁力放大生物傳感器(force amplified biological Sensor, FABS)的概念。通過待測樣品分子免疫結(jié)合微磁珠，在懸臂梁的垂直方向引入磁場，微磁珠由于受到磁力作用，引起懸梁臂的彎曲。由于用力量較大的磁場力代替原來較弱的重力，檢測靈敏度可以達到10-18M。

　　三、結(jié)束語

　　納米技術(shù)和生命科學是21世紀最前沿的兩大學科，納米技術(shù)的介入為生物傳感器的發(fā)展提供了無窮的想象空間�？偟恼f來，納米顆�？梢詮V泛地應(yīng)用于敏感分子的固定(納米金、碳納米管)、信號的檢測和放大 (納米金、納米磁粒子、熒光納米顆粒)、待側(cè)物質(zhì)的富集和濃縮(納米磁粒子)。由于納米結(jié)構(gòu)有著優(yōu)異的化學和物理性能，有著極高的比表面，有利于提高敏感分子的吸附能力，并能提高生化反應(yīng)的速度，因此被廣泛用于生物傳感器表面吸附層的制作，例如表面薄膜共振SPR檢測的等離子共振的金膜，氣體傳感器中催化劑固定的碳納米管以及懸臂梁結(jié)構(gòu)中提高吸附性能的納米膜等。此外，利用納米結(jié)構(gòu)的特性，可以制作全新的生物傳感器。實際上，生物分子本身就可以看作具有特定功能的納米器件，如酶分子對底物分子的識別和作用，它可以切斷底物分子的化學鍵并進行重組。細菌視紫紅質(zhì)的蛋白質(zhì)對光很敏感，當它暴露于光下時會發(fā)射出質(zhì)子，從而產(chǎn)生出可以檢測的微小電信號。它對特定頻率光的響應(yīng)受溶液中不同離子濃度的影響，因而可以用來檢測離子。

　　納米技術(shù)在生物傳感器的發(fā)展趨勢是集成多功能、便攜式、一次性的快速檢測分析機器，可廣泛用于食品、環(huán)境、戰(zhàn)場、人體疾病等領(lǐng)域的快速檢測，如食品和飲料中病原體或者農(nóng)藥殘留成分的快速靈敏檢測，環(huán)境中污染氣體或者污染金屬離子等遠程檢測和控制，人體血液成分和病原體的快速實時檢測，人體健康的長期監(jiān)測(如糖尿病患者血液中糖成分的長期監(jiān)測等)，以及戰(zhàn)場生化武器的快速檢測(如對炭疽病毒的檢測等)。

　　多種生物傳感器的集成或者生物傳感器陣列是生物傳感器發(fā)展的另一個趨勢，例如微電極陣列對二維微環(huán)境的檢測等。分子自組裝聚合物加工的研究呈上升趨勢，其加工工藝簡單可控，可以實現(xiàn)快速復制，而且成本較低，對生物傳感器的發(fā)展有很重要的促進作用，有利于高靈敏度、低成本、一次性的納米生物傳感器的發(fā)展。 其中生物分子自組裝技術(shù)更引人注目，如有機生物膜制作的納米膠囊，由于其天然的生物兼容性、優(yōu)異的特異結(jié)合性能，是生物傳感器發(fā)展的另一個全新領(lǐng)域。

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